Abstrak
Sebuah metodologi kemoenzimatik skala besar telah dikembangkan untuk menyiapkan analog alami dan tersubstitusi dari tetrasakarida Glikoforin A, di mana asam α-2,3-sialat dimodifikasi pada C5 atau C9 baik sebagai F, OMe, CH 3 , glikol atau N 3 . Strategi ini melibatkan sintesis kimia dari disakarida Gal-β-1,3-GalNAc di mana galaktosa tetap terasetilasi untuk pertama-tama memungkinkan α-2,6-sialilasi selektif menggunakan sistem enzim aldolase-NmCSS-Pd2,6-ST satu pot. Akhirnya, α-2,3 sialosida yang dimodifikasi C5 atau C9 ditempatkan pada bagian galaktosida menggunakan derivatif MaNAc yang dimodifikasi C2 atau C6 yang dikatalisis oleh kombinasi enzim aldolase NmCSS-Pd2,3-ST. Molekul yang disintesis dapat berguna dalam studi pengikatan dengan protein yang diinginkan atau sebagai titik masuk untuk membangun perpustakaan sampel analitis untuk studi spektrometri massa.
1 Pendahuluan
Sintesis karbohidrat skala Gram dulunya merupakan praktik rutin pada abad ke-20, [ 1 ] dimungkinkan oleh akses ke protokol sintetis yang andal. Sebagian, munculnya spektroskopi NMR medan tinggi telah merangsang sintesis skala kecil, yang menjadi lebih umum, sering kali mengorbankan kualitas dan reproduktifitas hasil. [ 2 ] Hal ini karena protokol skala kecil sering kali gagal ditingkatkan, memerlukan pengoptimalan ekstensif dan terkadang memerlukan pemikiran ulang tentang rute sintetis. Kami percaya bahwa sintesis karbohidrat skala besar harus tetap dipraktikkan untuk memastikan akses yang andal ke jumlah yang cukup untuk penelitian biologis dan struktural.
Pekerjaan yang dijelaskan di sini menunjukkan nilai pendekatan berskala besar dengan mensintesis komponen utama glikana Glikophorin A dan analognya dalam konteks program penemuan obat antimalaria.
Malaria, penyakit yang ditularkan melalui nyamuk, menimbulkan beban kesehatan global yang signifikan, khususnya di negara-negara berkembang. Pada tahun 2023, penyakit ini diperkirakan menyebabkan 219 juta infeksi dan 597.000 kematian, dengan sebagian besar kasus disebabkan oleh Plasmodium falciparum . [ 3 ] Siklus hidup parasit ini rumit, dengan tahap invasi sel darah merah (RBC) yang sangat penting bagi timbulnya dan perkembangan penyakit. [ 4 ] Memahami mekanisme molekuler invasi RBC dapat mengarah pada pengembangan strategi terapi baru, karena mengganggu proses ini dapat menghentikan kemampuan parasit untuk berkembang biak di dalam sel manusia.
Inti dari proses invasi sel darah merah adalah Glikoforin A, sebuah protein yang dihiasi dengan asam sialik di bagian terminal dan diekspresikan pada eritrosit manusia. [ 5 ] Asam sialik adalah keluarga gula sembilan karbon yang ditampilkan secara mencolok di ujung glikoprotein dan glikolipid pada permukaan sel. [ 6 ] Asam sialik, seperti asam N -asetilneuraminat (Neu5Ac) memainkan peran penting dalam pengenalan antar sel dan terlibat dalam proses seperti penghindaran imun dan interaksi patogen-inang. [ 7 ]
Dalam kasus malaria, parasit P. falciparum mengenali tetrasakarida sialilasi (Gambar 1 ) yang terletak pada permukaan sel darah merah, sehingga memungkinkan masuk ke dalam sel inang. [ 8 , 9 ] Secara spesifik, antigen pengikat eritrosit-175 (EBA-175), protein permukaan parasit, mengikat residu Neu5Ac pada Glikoforin A sehingga memudahkan invasi sel darah merah dan progresi menjadi penyakit. [ 10 ]
Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Struktur utama Glikoforin A O -glikan.
Mengingat pentingnya interaksi yang dimediasi oleh asam sialik, modifikasi pada posisi C9 asam sialik dalam glikokonjugat menyediakan alat ‘reporter’ yang berharga untuk menyelidiki detail molekuler pengikatan parasit. [ 11 , 12 ] Dengan mengubah struktur asam sialik, wawasan tentang interaksi spesifik antara parasit dan sel inang dapat diperoleh. [ 13 ] Asam sialik yang dimodifikasi ini diharapkan dapat berfungsi sebagai komponen kunci untuk menyelidiki dinamika pengikatan antara glikana tersialilasi dan EBA-175, menawarkan jalur potensial untuk merancang terapi berbasis karbohidrat.
Studi ini berfokus pada sintesis asam sialik yang dimodifikasi C5/C9 dan penggabungannya ke dalam glikokonjugat untuk mengeksplorasi perannya dalam interaksi antara glikoprotein sialilasi dan protein P. falciparum EBA-175. Memahami interaksi molekuler ini dapat membuka jalan bagi pengembangan pengobatan baru untuk menghentikan kemampuan parasit untuk menyerang sel darah merah.
2 Hasil dan Pembahasan
Sintesis tetrasakarida Glikoforin A dan analognya yang dapat diskalakan bergantung pada minimalisasi kromatografi dan penggunaan bahan awal yang murah untuk memastikan efisiensi dan reproduktifitas. Langkah kunci dalam proses ini adalah persiapan inti disakarida yang mudah [ 14 ] 1 , yang merupakan substrat yang dapat dikenali untuk sialilasi. Sialilasi α-2,6 selektif dari residu galaktosamin dicapai dengan mempertahankan galaktosa terminal yang diasetilasi. [ 15 ] Setelah sialilasi selesai, ester asetil dihilangkan secara kuantitatif dengan menggunakan basa untuk menghasilkan 2 yang memungkinkan asam sialik C5/C9 yang dimodifikasi yang tersisa untuk diglikosilasi secara enzimatis [ 16 ] untuk menghasilkan tetrasakarida akhir.
Rute sintetis kami menuju disakarida inti, diilustrasikan dalam Skema 1 , dimulai dengan konversi N- asetilglukosamin yang tersedia secara komersial menjadi akseptor berbasis galaktosamin melalui inversi konfigurasi C4. [ 17 ] Pertama, turunan glukosamin per- O -asetilasi 10 diolah dengan benzilamina, [ 18 ] diikuti dengan pemasangan trikloroasetimidat, [ 19 ] menghasilkan donor 11 dengan hasil 63% selama dua langkah. Glikosilasi donor ini dengan benzil alkohol, dikatalisis oleh trimetilsilil trifluorometanasulfonat (TMSOTf), [ 20 ] berlangsung lancar, menghasilkan glikosida 12 dengan hasil 86% setelah kristalisasi.
Skema 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Sintesis akseptor 1 .
Untuk aktivasi, suhu yang lebih tinggi (60 °C) diperlukan untuk memastikan konversi lengkap dari zat antara oksazolin menjadi produk glikosida 12. Senyawa 12 kemudian dideasetilasi dengan NaOMe dalam metanol, dan triol yang dihasilkan diperlakukan dengan tiga ekuivalen PivCl dalam piridina, yang mengarah pada perlindungan yang sangat selektif pada posisi 4 dan 6 untuk menghasilkan 13 dengan hasil 85%. [ 17 ] Regioselektivitas ini kemungkinan besar disebabkan oleh ikatan hidrogen yang kuat antara gugus asetamido dan hidroksil C4, yang menjadikan yang terakhir sebagai nukleofil yang buruk. [ 21 ]
Pembalikan konfigurasi 13 dicapai dengan perlakuan dengan anhidrida triflik, diikuti dengan penambahan air in situ, menghasilkan turunan galaktosamin 14 dalam 74%. Ester pivalat selanjutnya dihilangkan dengan NaOMe dalam metanol, dan 4,6- O -benzylidene asetal dipasang, menghasilkan senyawa 15 dalam 76% hasil selama dua langkah. Zat antara ini dimurnikan melalui kristalisasi, sehingga tidak perlu kromatografi.
Akhirnya, akseptor 15 digabungkan dengan asetobromogalaktosa menggunakan merkuri sianida (II) sebagai promotor, [ 22 ] menghasilkan disakarida 16 dengan hasil 78%. Setelah pembentukan ikatan glikosidik, benzilidena asetal dihilangkan dengan perlakuan asam asetat encer, menghasilkan 4,6-diol 1 dalam 75%, yang digunakan secara langsung dalam reaksi enzimatik berikutnya.
Untuk menggabungkan asam sialik yang dimodifikasi C9, kami memilih untuk menggunakan derivatif N- asetilmanosamin yang dimodifikasi C6, yang ketika terpapar aldolase asam sialik bakteri, menjadi sialosida yang dimodifikasi C9. [ 12 ] Pendekatan sintetis diuraikan dalam Skema 2. Pertama, ManNAc yang tersedia secara komersial diolah dengan benzil alkohol dengan adanya asetil klorida [ 23 ] untuk menghasilkan α-glikosida 18 , diikuti oleh pemasangan selektif gugus tert -butildifenil (TBDPS) pada C6 untuk menghasilkan 19 dengan hasil 63% selama dua langkah. Gugus hidroksil yang tersisa kemudian dibenzilasi untuk menghasilkan zat antara 20 , yang tanpa pemurnian lebih lanjut, diolah dengan sejumlah katalitik AcCl dalam metanol [ 24 ] untuk menghasilkan 21 dengan hasil 55% selama dua langkah. Spesies ini kemudian diekspos ke berbagai kondisi [ 25 ] untuk memperkenalkan baik kelompok ─OAc ( 22 ), ─F ( 23 ), ─CH 3 ( 24 ), atau ─OMe ( 25 ) dalam kuantitatif, 52%, 83%, dan 86% hasil masing-masing. Hidrogenolisis katalitik atas paladium hidroksida (20%, b/b) menghasilkan senyawa 26 – 29 dalam hasil kuantitatif siap untuk transformasi enzimatik ( Informasi Pendukung ).
Skema 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Sintesis turunan ManNAc yang dimodifikasi C6.
Dengan jumlah disakarida 1 yang cukup , α-2,6-sialilasi dari gugus galaktosamin dilakukan. Untuk tujuan ini, α-2,6-sialiltransferase bakteri multifungsi (Pd2,6ST) yang berasal dari P. damselae digunakan. [ 12 ] Reaksi enzimatik ini dilakukan dalam buffer yang mengandung 5% DMSO untuk memastikan akseptor disakarida 1 tetap dalam larutan. Dengan demikian, trisakarida 2 (700 mg) diperoleh dengan hasil 60% setelah perlakuan basa tambahan, yang siap untuk pemasangan akhir asam sialik yang dimodifikasi C9.
Langkah terakhir bergantung pada penggunaan turunan manosamin 26 – 32 , yang berada dalam satu pot yang diekspos ke E. coli aldolase dengan adanya piruvat yang mengakibatkan konversi menjadi asam sialik (Skema 3 ). NmCSS kemudian mengubah asam sialik menjadi substrat donor CMP-Neu5Ac yang dimodifikasi C9 yang sesuai, yang ditangkap oleh PmST1 dan ditransfer ke posisi C3 dari galaktosida. Prosedur satu pot ini [ 12 ] menghasilkan tetrasakarida 3 dalam hasil 62%, sementara hasil yang lebih tinggi diperoleh untuk 4 (79%) dan 7 (80%) yang menunjukkan bahwa beberapa modifikasi C9 meningkatkan efisiensi transfer asam sialik dan mungkin kurang tahan terhadap hidrolisis oleh PmST1 (langkah ini reversibel). Demikian pula, turunan Neu5Gc 8 diperoleh dalam hasil 86%. Di sisi lain, tidak ada reaksi yang diamati dengan substrat C9-OAc 22 , mungkin karena asetat merupakan bagian yang lebih besar sehingga memerlukan waktu reaksi yang lebih lama, dan pada titik tersebut, pada pH 8,5, asetat dapat mengalami pembelahan.
Skema 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Perakitan kemoenzimatik tetrasakarida.
3 Kesimpulan
Kesimpulannya, sintesis tetrasakarida motif Glikoforin A yang dapat diskalakan dan analognya telah dioptimalkan dengan menggunakan bahan awal yang hemat biaya dan meminimalkan kromatografi. Inti trisakarida utama disiapkan dari disakarida yang disintesis secara kimia 1 dengan menggunakan sialilasi yang sangat selektif dari gugus GalNAc yang tidak diasetilasi diikuti oleh penggabungan enzimatik asam sialik yang dimodifikasi C9 pada residu galaktosa. Pendekatan yang efisien ini, yang melibatkan sialilasi α-2,6- dan α-2,3-selektif, menghasilkan hasil tetrasakarida 3 – 8 yang tinggi dengan modifikasi C9 tertentu yang meningkatkan efisiensi transfer ( 4 dan 7 ). Hasil ini memberikan metode yang kuat dan dapat direproduksi untuk sintesis glikana skala besar, yang penting, misalnya ketika glikana atau fragmen glikana yang ditentukan diperlukan untuk eksperimen spektrometri massa atau pengikatan protein.
