Abstrak
Spektrometri massa ikatan silang in vivo (XL-MS) memungkinkan karakterisasi kompleks protein di seluruh proteom dalam sel hidup. Namun, sebagian besar metode XL-MS menghadapi kehilangan sampel yang signifikan selama pengayaan, membatasi aplikasinya pada sampel dengan jumlah terbatas, dan mengalami reproduktifitas yang buruk (20%-40%), sehingga menghambat kuantifikasi yang tepat. Untuk mengatasi tantangan ini, kami mengembangkan pengikat silang permeabel membran baru, 2,6-dimetilpiperidina disuccinimidyl tridecanoate (DPST), di mana gugus dimetilpiperidinil memungkinkan pengayaan satu langkah peptida ikatan silang melalui pendekatan antibodi Tandem Mass Tags (TMT), menghilangkan kehilangan sampel dari proses multi-langkah dan memungkinkan analisis dari sedikitnya sel 1E4. DPST juga memungkinkan pelabelan isotop ringan dan berat dari sampel ikatan silang pada tingkat seluler, yang mengurangi ketidakakuratan dari persiapan multi-langkah. Hal ini menghasilkan ion reporter untuk kuantifikasi MS2 yang tepat, meningkatkan rasio signal-to-noise tanpa meningkatkan kompleksitas spektral. Dengan menggunakan DPST, kami menganalisis ikatan silang pada neuron primer dari tikus janin tunggal dan mengukur interaksi sementara dan lemah dalam lingkungan pemisahan fase cair-cair (LLPS) yang dinamis. Selain itu, desain DPST mendukung beberapa konfigurasi pelabelan isotop (misalnya, 6-plex, 10-plex). Oleh karena itu, DPST menyediakan alat yang dapat diskalakan dan tangguh untuk analisis kualitatif dan kuantitatif berbasis XL-MS in vivo pada sel hidup, bahkan dengan jumlah sampel yang terbatas.
Pengayaan Satu Langkah dan Analisis Kuantitatif Kompleks Protein In Vivo melalui Dimethylpiperidine Cross-Linker DPST
